Die dichte- und temperaturgesteuerte Flüssigkeitsextraktion in einem bakteriellen Biofilm wird durch Poly bestimmt

npj Biofilms and Microbiomes Band 8, Artikelnummer: 98 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Ein Kennzeichen mikrobieller Biofilme ist die Eigenproduktion einer extrazellulären molekularen Matrix, die die ansässigen Zellen umhüllt. Die Matrix bietet Schutz vor der Umwelt, während die räumliche Heterogenität der Genexpression die strukturelle Morphologie und die Dynamik der Kolonieausbreitung beeinflusst. Bacillus subtilis ist ein Modellbakteriensystem, das zur Aufdeckung der Regulierungswege und Schlüsselbausteine ​​verwendet wird, die für das Wachstum und die Entwicklung von Biofilmen erforderlich sind. In dieser Arbeit berichten wir über die Entstehung einer hochaktiven Bakterienpopulation in den frühen Stadien der Biofilmbildung, die durch die Extraktion von Flüssigkeit aus dem darunter liegenden Agarsubstrat erleichtert wird. Wir führen den Ursprung dieser Flüssigkeitsextraktion auf die Produktion von Poly-γ-glutaminsäure (PGA) zurück. Die Flagellen-abhängige Aktivität entwickelt sich hinter einer sich bewegenden Flüssigkeitsfront, die sich von der Grenze des Biofilms ins Innere ausbreitet. Das Ausmaß der Flüssigkeitsproliferation wird durch das Vorhandensein extrazellulärer Polysaccharide (EPS) gesteuert. Wir stellen außerdem fest, dass die PGA-Produktion positiv mit höheren Temperaturen korreliert, was zu reifen Biofilmmorphologien bei hohen Temperaturen führt, die sich von der Biofilmarchitektur der Rugose-Kolonie unterscheiden, die typischerweise mit B. subtilis in Verbindung gebracht wird. Obwohl frühere Berichte darauf hindeuteten, dass die PGA-Produktion keine große Rolle bei der Biofilmmorphologie im nicht domestizierten Isolat NCIB 3610 spielt, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass dieser Stamm als Reaktion auf Umweltbedingungen unterschiedliche Biofilmmatrizen produziert.

Eine gängige Strategie von Bakterien, um den durch ihre Umwelt verursachten Stress zu mildern, besteht darin, in sessilen Gemeinschaften, sogenannten Biofilmen, zusammenzuleben. Der Übergang vom einzelligen zum mehrzelligen Leben ermöglicht es den Bewohnern, Reaktionen auf Reize zu koordinieren, Stoffwechsellasten zu teilen1 und sich vor äußeren Angriffen durch Raubtiere2,3 oder antimikrobielle Wirkstoffe4,5 zu schützen. Dieses Verhalten ist in der mikrobiellen Welt allgegenwärtig und ein klares Verständnis der Entstehung, Entwicklung und Reifung von Biofilmen ist sowohl aus grundlegender mikrobiologischer Sicht als auch aufgrund ihrer Auswirkungen auf viele industrielle, klinische und biotechnologische Bereiche wichtig. Biofilme dienen beispielsweise als Quelle für viele chronische Infektionen und ihre physikalischen Eigenschaften machen es schwierig, sie auszurotten6,7. Diese Unnachgiebigkeit kann sich auch auf industrielle Prozesse auswirken, bei denen Biofilme zu Rohrverstopfungen führen, Korrosion auslösen oder Produkte verunreinigen können8,9,10. Obwohl die Bildung von Biofilmen viele negative Folgen hat, spielen mikrobielle Biofilme eine entscheidende Rolle bei der Abwasseraufbereitung und anderen biologischen Sanierungsprozessen11,12,13,14 und das Verständnis ihrer Entstehung sowie ihrer Zerstörung ist von grundlegendem Interesse.

Bacillus subtilis ist ein grampositives Bakterium, das häufig als Modellorganismus zur Untersuchung der genetischen Regulation und der molekularen Mechanismen der Biofilmbildung eingesetzt wird15,16. Die Hauptbestandteile der von B. subtilis produzierten Matrix sind das fibrilläre Protein TasA17, das Hydrophobin-ähnliche Proteintensid BslA18,19,20 und das durch Produkte des epsA-O-Operons21 synthetisierte Polysaccharid. Einer der wichtigsten Regulationswege, der die Expression dieser Komponenten steuert, wird durch den Transkriptionsfaktor Spo0A moduliert, wobei moderate Mengen an phosphoryliertem Spo0A die Transkription des sinI-sinR-Operons aktivieren22,23. SinR ist ein DNA-bindender Transkriptionsfaktor, der die Matrixproduktion durch Interaktion mit den Promotoren epsA-O und tapA-sipW-tasA steuert24. Wenn SinR an seine Antagonistenproteine ​​(SinI und SlrR) bindet, wird die Repression dieser Operons gemildert und die Biofilmbildung kann voranschreiten25,26.

In dieser Arbeit berichten wir über die Beobachtung mehrerer wandernder Flüssigkeitsfronten, die sich im frühen Stadium der Biofilmbildung der B. subtilis-Kolonie entwickeln. Nach der anfänglichen Ablagerung der Gründungszellen entsteht eine hochbewegliche Bakterienpopulation, die in der Flüssigkeit schwimmt, die aus dem darunter liegenden Agarsubstrat extrahiert wird. Wir verknüpfen diese sich bewegende Flüssigkeitsfront genetisch mit der Produktion des Polymers Poly-γ-glutaminsäure (PGA). Wir stellen fest, dass der Flüssigkeitszustrom sowohl von der Bakteriendichte als auch von der Umgebungstemperatur abhängt und dass das Ausmaß der Flüssigkeitsinfiltration wiederum durch die Produktion von extrazellulärem Polysaccharid (EPS) moduliert wird. Die Produktion von PGA bei höheren Temperaturen und die damit einhergehende Extraktion von Flüssigkeit haben erhebliche Auswirkungen auf die Morphologie des reifen Biofilms, die von der typischen Struktur von B. subtilis NCIB 3610 abweicht. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass B. subtilis die Fähigkeit besitzt, eine Alternative zu produzieren extrazelluläre Matrix als Reaktion auf die Umweltbedingungen.

Zu Beginn jedes Experiments wurde eine 3-μL-Suspension von B. subtilis-Zellen (OD600 = 1) auf MSgg-Agar, einem Biofilm-fördernden Minimalmedium, aufgetragen27. Nach der Beimpfung verdunstet das Tröpfchen, was zu einem Ablagerungsmuster eines „Kaffeerings“ führt: Am Rand des ursprünglichen Tröpfchens bildet sich ein hochdichter Ring aus Bakterienzellen, während das Innere dünner besiedelt ist (Abb. 1a). Diese Verteilung der Gründungszellen wird durch die unterschiedliche Verdunstungsrate im Tröpfchen verursacht, wodurch Kapillarströme entstehen, die Zellen aus dem Inneren zur Grenze zwischen Tröpfchen und festem Agar transportieren28. Unsere ersten Experimente wurden mit dem Wildtyp-Isolat NCIB 3610 durchgeführt, das bei 38 °C gezüchtet wurde, während gleichzeitig zeitaufgelöste Bilder gesammelt wurden. Die Bilder wurden durch Bildgebung durch das Agarsubstrat aufgenommen, sodass wir die Wachstumsdynamik auf der Unterseite des Biofilms beobachteten (Abb. 1a). Wir haben Bilder für die ersten ca. 6 Stunden des Wachstums aufgenommen (Abb. 1b – d). Die hochdichte „Kaffeering“-Region ist deutlich an der großen Ansammlung von Bakterienzellen nahe der äußeren Grenze der Kolonie zu erkennen (Abb. 1b). Dieser Bereich mit hoher Bakteriendichte scheint vielschichtig mit einer Breite von 75–100 μm zu sein.

a Ein 3-μL-Tropfen einer Bakteriensuspension wird auf die Oberfläche von MSgg-Agar aufgetragen und trocknen gelassen. Aufgrund der unterschiedlichen Verdunstungsraten an der Oberfläche des Tropfens (blaue Pfeile) werden Kapillarströmungen im Inneren des Tropfens induziert. Dies ermöglicht den Transport von Bakterien vom Inneren des Tropfens zum Rand, wo sie sich ablagern. Der Effekt besteht darin, dass sich an der Kontaktlinie zwischen Tröpfchen und festem Agar ein Bereich mit höherer Bakteriendichte ansammelt. b Dieser Bereich mit höherer Bakteriendichte ist am Rand der Kolonie zu erkennen (t = 60 min). c Nach drei Stunden Inkubation und Wachstum entwickelt sich ein dunklerer Bereich mittig am Rand des entstehenden Biofilms. Wir stellen fest, dass diese Zone flüssig ist und beginnt, sich nach innen in Richtung der Mitte der Kolonie zu bewegen (blaue Pfeile; t = 220 min). In dieser Zone beobachten wir aktive und bewegliche Zellen. d Nach weiteren zwei Stunden hört die Front auf, sich nach innen zu bewegen, angedeutet durch die weiße gestrichelte Linie, und die Motilität stoppt (t = 330 min). Die Maßstabsbalken (b)–(d) betragen 500 μm. e PIV-Analyse, die das Geschwindigkeits-Magnituden-Feld eines Wildtyp-Biofilms über ein Intervall von zwei Bildern (10 fps) zeigt. Der blaue Bereich ist der Biofilm der Kolonie; Der rote Bereich ist das Agar. Das Bild wurde ca. 4,5 Stunden nach der Abscheidung aufgenommen. f Mithilfe einer Partikelverfolgungssoftware werden die Perlen lokalisiert (rosa) und ihre Bewegung über die Zeit verfolgt (gelbe Linien). Die meisten Perlen bewegen sich linear mit konstanter Geschwindigkeit in Richtung des Inneren der Kolonie. Das Bild wurde ca. 200 Minuten nach der Abscheidung aufgenommen. Maßstabsbalken (e)–(f) 100 μm.

Nachdem NCIB 3610 etwa 3 Stunden lang gewachsen ist, beobachten wir eine Zone, die aus dem Bereich mit hoher Dichte hervorgeht und sich optisch vom Inneren der Kolonie unterscheidet (vgl. den dunklen Ring am Rand im Vergleich zum helleren Inneren in Abb. 1c). . Diese dunklere Zone wächst und bewegt sich als Wanderfront nach innen in Richtung des Koloniezentrums (Zusatzfilm 1). Innerhalb dieser Zone beobachten wir kohärente Muster selbstorganisierter Bewegung wie Wirbel und Wirbel, die an Strukturen erinnern, die in aktiven turbulenten Systemen beobachtet werden (Zusatzfilm 2)29,30, was darauf hindeutet, dass sich die Bakterien jetzt in einer flüssigen Umgebung befinden. Wir verwendeten Particle Image Velocimetry (PIV), um diese Bewegung weiter zu bewerten. Wir fanden lokalisierte Regionen mit hoher Wirbelstärke und Geschwindigkeiten im Bereich von 1 bis 10 μm/s mit einem Mittelwert von 2,1 μm/s (Abb. 1e, ergänzende Abbildung 1, ergänzende Filme 3, 4). Um festzustellen, ob diese auftretenden Muster auf passive Advektion der Bakterien aufgrund von Flüssigkeitsströmen zurückzuführen sind oder ob die Beweglichkeit der Bakterien beteiligt war, haben wir ähnliche Experimente und PIV an einem nicht beweglichen Stamm durchgeführt, der eine Deletion von motB aufweist, einem Flagellenstatorelement, das für erforderlich ist Flagellenrotation. Wir haben festgestellt, dass wir keine Wirbel beobachten wie bei NCIB 3610 (ergänzende Abbildung 2). Darüber hinaus liegt die Durchschnittsgeschwindigkeit für den motB-Stamm um eine Größenordnung unter der von NCIB 3610 (Ergänzende Abbildungen 2, 3). Diese Beobachtungen stützen die Idee, dass aktive Flagellen oder Motilität für die Bildung dieser dynamischen Merkmale wichtig sind. Ob diese Muster ein Beispiel für aktive Turbulenzen aufgrund der bakteriellen Motilität29 oder aufgrund einer Kopplung zwischen Flagellenschlag und dem Flüssigkeitsfluss aus dem darunter liegenden Agar in die Kolonie sind, liegt außerhalb des Rahmens dieser Arbeit. Unabhängig davon zeigen diese Ergebnisse, dass sich die Bakterien in dieser Phase des Koloniewachstums in einer flüssigen Umgebung befinden. Dieses Aufhören der Motilität/Aktivität erfolgt auch als Ausbreitungsfront (die „Motilitätsstillstandsfront“), verläuft jedoch viel schneller als die anfängliche Ausbreitung der Flüssigkeit und bewegt sich überwiegend vom inneren Ring des Anulus zurück zum äußeren anfänglichen Kaffeering (Kommentierte Filme zu diesen Dynamiken finden Sie in den Zusatzfilmen 5 und 6).

Um diese Flüssigkeitsfront weiter zu untersuchen, fügten wir der Bakteriensuspension, die zu Beginn des Experiments abgelagert wurde, fluoreszierende Perlen mit einer Größe von 2 μm hinzu (Abb. 1e, Zusatzfilm 7). Durch den Flüssigkeitszufluss werden die Perlen mit einer konstanten Geschwindigkeit von ≈2,5 μm min−1 vorwärts geschoben (Abb. 1f). Somit hat die Bewegung dieser Front die Fähigkeit, Perlen und wahrscheinlich auch Zellen mechanisch in Richtung der Mitte der Kolonie zu verschieben und zu drücken. In späteren Stadien werden einige Kügelchen in ihrer Bewegung unregelmäßig, was wahrscheinlich darauf hindeutet, dass Kügelchen durch die Schwimmbewegung der Bakterien in einer flüssigen Umgebung in Bewegung gesetzt werden; ein weiterer Teil der Perlen bleibt in der Bakterienmasse eingebettet.

Wir beobachteten durchweg die Bildung eines Flüssigkeitsrings beginnend am äußeren Rand des Biofilms und nicht die Überschwemmung der gesamten Kolonie mit Flüssigkeit. Wir gehen davon aus, dass die Beschränkung der Flüssigkeit auf einen äußeren Ringraum auf die Produktion extrazellulärer Matrix im zentralen Bereich des Biofilms zurückzuführen ist, wodurch ein weiteres Eindringen von Flüssigkeit verhindert wird. Wir haben das gleiche Experiment wie in Abb. 1a beschrieben mit einem Stamm durchgeführt, in dem der Schlüsselrepressor der Biofilmbildung (sinR) deletiert ist. Ohne sinR überproduzieren die Bakterien die extrazelluläre Matrix und stark faltige Biofilme der Kolonien beanspruchen eine kleinere Fläche (ergänzende Abbildung 4)24. Wie vorhergesagt, war der maximale Abstand, den die Flüssigkeit relativ zum äußeren Rand der Kolonie in das Innere des Biofilms eindrang (Ergänzende Abbildungen 5, 6; Zusatzfilm 8), beim sinR-Stamm etwa dreimal kleiner als beim NCIB 3610-Stamm ( Abb. 2).

Aufgetragen ist die durchschnittliche Wegstrecke der Flüssigkeit, gemessen vom Rand des Biofilms. Beachten Sie, dass die y-Achse eine logarithmische Skala aufweist, um die Unterschiede zwischen den Stämmen NCIB 3610, sinR, tasA sowie bslA und epsA-O anzuzeigen. Jeder Datenpunkt ist die mittlere Flüssigkeitswegdistanz, gemittelt über 10 räumliche Punkte über einen einzelnen Biofilm (N = 3 für jeden Stamm). Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Bei der epsA-O-Belastung ist zu beachten, dass die von der Flüssigkeit zurückgelegte Strecke lediglich die Größe der Kolonie widerspiegelt, da die von der Grenze austretende Flüssigkeit nicht auf einen Ringraum beschränkt ist, sondern sich in der Mitte trifft. Hier berichten wir über Entfernungen für drei separate Experimente. Ein ungepaarter t-Test zwischen NCIB 3610 und jeder Matrixmutante ergibt p-Werte von ****p < 0,0001 (sinR), ****p < 0,0001 (tasA), **p = 0,0025 (bslA, *** *p < 0,0001 (epsA-O)). p < 0,05 gilt als statistisch signifikant.

Als nächstes wollten wir feststellen, ob eine oder mehrere einzelne Komponenten der Matrix das Ausmaß des Flüssigkeitsflusses dominieren. Wir führten analoge Experimente an Stämmen mit Deletionen in Genen durch, die für die Produktion von BslA (bslA), TasA (tasA) und EPS (epsA-O) verantwortlich sind, und maßen dabei wiederum die Distanz der Flüssigkeitsbewegung. Wir fanden heraus, dass sich die Flüssigkeit im bslA-Stamm im Vergleich zu NCIB 3610 weiter bewegte, während der Flüssigkeitsfluss im tasA-Stamm weniger wanderte (Abb. 2, ergänzende Abbildungen 5, 7, 8; ergänzende Filme 9, 10, 11). Obwohl die Unterschiede zwischen NCIB 3610 und diesen Matrixkomponenten statistisch signifikant sind, ist die Flüssigkeit immer noch in einem ringförmigen Bereich innerhalb der Kolonie enthalten. Beim epsA-O-Stamm war die Flüssigkeit jedoch nicht auf einen ringförmigen Bereich beschränkt, sondern breitete sich über den gesamten Radius der Kolonie aus (Abb. 2, Zusatzfilm 12) und überall war Zellaktivität zu beobachten. Die Aktivität war hochdynamisch und wir beobachteten eine Wirbelbildung, die für aktive Turbulenzen charakteristisch ist (Zusatzfilm 13). Auch hier führten wir eine PIV-Analyse durch und fanden Regionen mit hoher Vorticity und einer Geschwindigkeitsverteilung ähnlich dem Wildtyp-Stamm (Ergänzende Abbildung 9, Ergänzende Filme 14, 15). Die Motilitätsstoppfront ist in der epsA-O-Mutante deutlicher zu erkennen und verläuft wie die Flüssigkeitsausbreitungsfront über die gesamte Kolonie (für bearbeitete und kommentierte Filme der epsA-O-Biofilmdynamik siehe Zusatzfilme 16 und 17). Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass EPS die primäre extrazelluläre Matrixkomponente ist, die das Ausmaß der Flüssigkeitsinvasion in den Biofilm steuert.

Der epsA-O-Stamm ermöglichte es uns, den Flüssigkeitsfluss durch die gesamte Kolonie zeitaufgelöst zu verfolgen und mehr über den Flüssigkeitsextraktionsprozess zu erfahren. Wir haben festgestellt, dass sich eine fingerartige Instabilität entwickelt, wenn sich die Flüssigkeit nach innen ausbreitet (Abb. 3a; Zusatzfilme 8, 16–18). Wenn die Flüssigkeit in Richtung der Mitte der Kolonie vordringt, wird die Flüssigkeitsfront instabil und bildet mit der Zeit immer größere Finger (Abb. 3a, b). Die durch diese Instabilitäten gebildeten Muster erinnern an das Faltenmuster, das in reifen Biofilmen beobachtet wird.

a Ein Beispiel für ein Mikroskopbild eines gesamten epsA-O-Biofilms (Maßstabsbalken ist 500 μm). Der ringförmige schwarze Bereich definiert den Bereich, in dem wir fingerartige Instabilitäten beobachten. Dieser ringförmige Bereich ist zur leichteren Visualisierung linear gestaltet; An der roten Linie wird ein Schnitt gemacht und der kreisförmige Bereich wird „abgerollt“, um einen linearen Bereich zu bilden. b Binarisierte Bilder der Finger im Zeitverlauf für den Biofilm in (a). c Die normalisierte Verschiebung als Funktion der Zeit für den äußeren Rand der Kolonie (schwarze Kreise), die Flüssigkeitsfront (grüne Rauten) und die Motilitätsstillstandsfront (orangefarbene Quadrate). Ein Plateau in der Randausdehnung tritt zeitgleich mit dem Beginn der Flüssigkeitsausbreitung auf (was wir als „Fluidisierungsplateau“ definieren; rotes Kästchen). Das Wachstum setzt wieder ein, nachdem die Motilität zum Stillstand gekommen ist. Die grüne Kurve entspricht dem Zeitpunkt, zu dem wir die Entwicklung der Finger in (a) beobachten.

Die Abbildung des Flüssigkeitsflusses in Biofilmen von Kolonien auf diese Weise ermöglichte es uns, drei Schlüsselmerkmale der Dynamik vollständig zu verfolgen: (1) die Distanz, die der expandierende Außenrand der wachsenden Kolonie zurücklegt; (2) die vom Flüssigkeitsfluss zurückgelegte Strecke, wie oben; und (3) die Motilitätsarrestfront. Alle Messungen wurden relativ zur Anfangsposition (r0) jedes Merkmals durchgeführt und die relativen Abstände wurden auf ihren Maximalwert normiert, um einen direkten Vergleich ihrer zeitabhängigen Entwicklung zu ermöglichen. Erstens beginnt sich der äußere Rand der Kolonie nach einer Verzögerungszeit mit konstanter Geschwindigkeit auszudehnen, wie in Abb. 3c dargestellt. Diese Expansion nach außen verlangsamt sich jedoch und kommt dann genau zu dem Zeitpunkt zum Stillstand, zu dem wir sehen, wie sich die Flüssigkeitsfront vom Kaffeering in das Innere der Kolonie auszubreiten beginnt. Wir vermuten, dass der Flüssigkeitszufluss zu einer „Fluidisierung“ der inneren Biofilmmasse führt und der daraus resultierende Mangel an mechanischer Robustheit die weitere Ausbreitung des Biofilms nach außen verhindert. Erst mit dem Einsetzen der Motilitätsstillstandsfront – und der erneuten Verfestigung des Inneren – kann es zu einer weiteren Expansion am äußeren Rand des Biofilms kommen. Wir bezeichnen diese Pause in der Biofilmausdehnung aufgrund des Flüssigkeitszuflusses als „Fluidisierungsplateau“ (roter Kasten, Abb. 3c) und können damit Veränderungen in den Biofilmeigenschaften untersuchen.

Auffallend ist, dass sich die Flüssigkeitsfront überwiegend radial vom „Kaffeering“ in das Zentrum der Kolonie bewegt. Dies legt nahe, dass die für die Flüssigkeitsextraktion verantwortlichen Molekülspezies in zelldichteabhängiger Weise produziert werden. Um diese Hypothese zu testen, haben wir Koloniebiofilme mit und ohne einen anfänglichen Bereich mit hoher Dichte hergestellt, indem wir eine Bakteriensuspension auf den Agar aufgeschleudert haben. Proben mit einer heterogenen Zellverteilung (kaffeeringartig) extrahieren Flüssigkeit immer mit einer Richtung: Flüssigkeit breitet sich immer von Regionen mit hoher Dichte zu Regionen mit niedriger Dichte aus (Ergänzungsfilme 19, 20). Im Gegensatz dazu führt eine homogene Ablagerung von Zellen letztendlich dazu, dass Flüssigkeit überall gleichzeitig in die Kolonie eindringt, ohne Ausbreitungsrichtung (Ergänzungsfilme 21, 22). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine gewisse kritische Zelldichte erforderlich ist, um die Flüssigkeitsextraktion zu induzieren.

Wir wollten die molekularen Spezies identifizieren, die für den Flüssigkeitsfluss und die daraus resultierende Aktivität und Wachstumsdynamik verantwortlich sind. Surfactin war ein offensichtlicher Kandidat: Es handelt sich um ein von B. subtilis produziertes Lipopeptid, das ein wirksames Biotensid31 und ein wirksames antimikrobielles Mittel32 ist. Die Surfactinproduktion in B. subtilis-Biofilmen erleichtert die Kolonieausbreitung33 und ist wichtig für die osmotische Extraktion von Flüssigkeit aus dem darunter liegenden Agarsubstrat34. Um zu testen, ob Surfactin der Erreger der von uns beobachteten Dynamik ist, haben wir srfAA aus den Wildtyp- und epsA-O-Hintergrundstämmen gelöscht. Als Diagnose haben wir die relative Verschiebung r der Biofilmkante relativ zur Anfangsposition der Kante r0 als Funktion der Zeit gemessen (Abb. 4a). Wenn Surfactin für den Flüssigkeitsfluss in den wachsenden Biofilm verantwortlich ist, sollte die Löschung von srfAA zu einer ungehinderten Kolonieexpansion führen. Wir fanden jedoch heraus, dass sowohl die Stämme srfAA als auch srfAA epsA-O das charakteristische „Fluidisierungsplateau“ aufwiesen, das der Elternstamm zeigte (Abb. 4a); Daher ist Surfactin nicht der Erreger der beobachteten Flüssigkeitsextraktion.

a Messungen der Außenkantenverschiebung bei 38 °C zeigen, dass die Stämme NCIB 3610 (schwarze Kreise), epsA-O (grüne Rauten), srfAA (lila Plus) und srfAA epsA-O (grauer Stern) die charakteristische „Fluidisierung“ aufweisen Plateau'. Die Stämme pgsB minus (orangefarbenes Quadrat) und pgsB epsA-O minus (Cyan-Kreuz), die kein PGA produzieren können, zeigten dieses Verhalten nicht. Koloniemorphologie nach 48-stündiger Inkubation bei 38 °C von b NCIB 3610, c pgsB, d srfAA, e epsA-O, f pgsB epsA-O und g srfAA epsA-O. Der Maßstabsbalken beträgt 5 mm.

Poly-γ-Glutaminsäure ist ein natürlich vorkommendes Biopolymer, das aus wiederkehrenden Einheiten von L-Glutaminsäure, D-Glutaminsäure oder beiden besteht und von Bacillus-Arten produziert wird35,36. Die PGA-Produktion ist dichteabhängig37, was mit unseren Beobachtungen übereinstimmt, und hat feuchtigkeitsspendende Eigenschaften38,39. Um zu testen, ob PGA für die Flüssigkeitsextraktion verantwortlich ist, haben wir pgsB aus den Wildtyp- und epsA-O-Hintergrundstämmen gelöscht. PgsB ist die essentielle Synthetase, die für die PGA-Produktion erforderlich ist40. Wir beobachteten ein Fluidisierungsplateau in der Kolonieexpansion für die Wildtyp- und epsA-O-Stämme, nicht jedoch für die beiden pgsB-Mutanten (Abb. 4a). Wenn PGA fehlt, „verflüssigt“ sich der Biofilm nicht und die Biofilmexpansion setzt sich ununterbrochen fort. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass PGA das molekulare Mittel ist, das dem Substrat Flüssigkeit entzieht und so den Beginn der Motilität und die Fluidisierung des Biofilms vorantreibt.

Wir haben auch die Biofilmmorphologie nach 48 Stunden Inkubation abgebildet und festgestellt, dass der Wildtyp und die pgsB-Mutante morphologisch ähnlich sind (Abb. 4b, c). Die beiden epsA-O-Stämme sind ebenfalls vergleichbar, unterscheiden sich jedoch von der Wildtyp-Morphologie (Abb. 4e, f). Der Vollständigkeit halber haben wir auch die Surfactin-Mutanten-Biofilme abgebildet und festgestellt, dass der srfA-Stamm strukturiert ist, aber einen kleinen Platzbedarf einnimmt, während der doppelte srfA-pgsB-Mutant weniger strukturiert ist, ähnlich wie die anderen nicht-EPS-produzierenden Stämme (Abb. 4d, g). . Daher verändert der Flüssigkeitsfluss in den Biofilm der Kolonie zu frühen Zeiten, wie oben erläutert, die Morphologie nicht nennenswert, und die Matrixproduktion bestimmt immer noch die strukturellen Phänotypen der reifen Biofilme.

Unsere erste Analyse wurde bei 38 °C durchgeführt, während die meisten anderen Studien zur Untersuchung der Biofilmbildung von B. subtilis typischerweise zwischen Raumtemperatur und 30 °C durchgeführt werden. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass die PGA-Produktion nicht nur von der Zelldichte, sondern auch von der Temperatur abhängt. Um diese Hypothese zu testen, wiederholten wir die Experimente zur Untersuchung des Flüssigkeitsflusses und der Kolonie-Biofilmmorphologie mit Wildtyp-, epsA-O-, pgsB- und pgsB-epsA-O-Stämmen bei zusätzlichen Temperaturen von 30 °C und 42 °C (der höchsten erreichbaren Temperatur). in unserem Mikroskopie-Inkubator). Bei 30 °C beobachteten wir bei keinem der Stämme einen Flüssigkeitsfluss in den Biofilm der Kolonie und kein Fluidisierungsplateau in der Randausdehnung, auch nicht bei den Wildtyp- und epsA-O-Stämmen (Abb. 5a). Dieses Ergebnis legt nahe, dass PGA bei 30 °C nicht produziert wird. Bei den höheren Temperaturen von 38 ∘C und 42 ∘C finden wir ein Plateau in den Kantenausdehnungskurven für die Stämme, die PGA produzieren können, obwohl das Plateau bei der höheren Temperatur weniger ausgeprägt ist. Für die PGA-defizienten Mutanten wird kein Plateau beobachtet (Abb. 4a und 5b).

a Messungen der Kantenausdehnung bei 30 ∘C und b 42 ∘C für NCIB 3610 (schwarzer Kreis), epsA-O (grüne Raute), pgsB (orangefarbenes Quadrat), pgsB epsA-O (cyanfarbenes Kreuz). Koloniemorphologie nach 48-stündiger Inkubation bei c–f 30 ∘C und g–j 50 ∘C. Der Maßstabsbalken beträgt 5 mm. k Analyse der PGA-Häufigkeit durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proben, die aus NCIB 3610 und pgsB nach Wachstum bei 38 ∘C und 50 ∘C extrahiert wurden.

Wir fanden außerdem heraus, dass NCIB 3610 bei 50 °C äußerst schleimige Kolonien auf MSgg-Agarplatten bildet (Abb. 5g). Die Schleimhaut war so groß, dass beim Umdrehen der Petrischale die Biomasse auf den Deckel tropfte. Wir beobachteten ähnliche Phänotypen für Kolonien, die nicht in der Lage waren, EPS und Surfactin zu produzieren (Abb. 5h, ergänzende Abb. 10). Wir fanden heraus, dass der mukoide Phänotyp direkt mit der PGA-Produktion zusammenhängt, da die pgsB-Deletionsstämme vollständig nicht schleimig waren (Abb. 5i, j). Zur Vervollständigung wurden dieselben Stämme bei 30 °C untersucht, und es wurde kein Unterschied in der Struktur der Biofilmarchitektur der NCIB 3610- und pgsB-Kolonie beobachtet (Abb. 5c, e); Ebenso sind die epsA-O- und pgsB-epsA-O-Mutanten morphologisch vergleichbar (Abb. 5d, f). Zur Unterstützung der phänotypischen Daten haben wir die Biomasse von NCIB 3610- und pgsB-Stämmen gesammelt, die bei 38 °C und 50 °C gezüchtet wurden, und die Produktion von PGA biochemisch bewertet. Wir kommen zu dem Schluss, dass 3610 bei 50 °C große Mengen an PGA produziert, bei 38 °C jedoch nicht (Abb. 5K). Matrixmutanten von NCIB 3610, die Deletionen in bslA, tasA und epsA-O enthalten, bilden bei 50 °C ähnlich schleimige Biofilme (ergänzende Abbildung 10). Nur die Mutante mit einer Deletion in sinR erzeugt, während sie noch schleimig ist, einen Biofilm mit rauen Strukturmerkmalen (ergänzende Abbildung 10). Insgesamt stützen unsere Daten die Schlussfolgerung, dass PGA in NCIB 3610 sowohl zelldichte- als auch temperaturabhängig produziert wird, und zeigen, dass die Architektur und Struktur des Biofilms unter bestimmten Bedingungen dramatisch durch die Produktion von PGA beeinflusst werden kann.

Wir haben gezeigt, dass B. subtilis PGA produziert, das einen Flüssigkeitsfluss in eine wachsende Biofilmkolonie induziert. Dieses Aufquellen der Flüssigkeit führt zu einer von den Flagellen der Zelle abhängigen Aktivität, die unter diesen hohen Dichten und beengten Bedingungen zu einer turbulenten Dynamik führt. Es ist allgemein bekannt, dass sich bewegliche und biofilmmatrixproduzierende Zellzustände gegenseitig ausschließen41,42; einzelne Zellen können sich nur in einem der beiden Zustände befinden. Es wurde außerdem gezeigt, dass sowohl für grampositive als auch für gramnegative Arten häufig eine aktive Geißelmotilität für die Biofilmentwicklung erforderlich ist und dass diese eine vielfältige Rolle spielt43,44,45,46,47,48.

Es ist noch nicht klar, welche Rolle die PGA-induzierte Motilität bei der Entwicklung des B. subtilis-Biofilms spielen könnte. Es ist faszinierend, dass dieselben Transkriptionsregulatoren, die für die Motilität49 erforderlich sind, auch für die PGA-Synthese37,50,51 notwendig sind. Frühere Arbeiten haben jedoch auch gezeigt, dass es einen umgekehrten Zusammenhang zwischen der PGA-Synthese und der Flagellenfunktion gibt52,53, was darauf hindeutet, dass die von uns beobachtete Motilität möglicherweise einfach ein Nebenprodukt der Tatsache ist, dass sich die Zellen in einer flüssigen Umgebung befinden. Die genauen Regulierungsmechanismen, die die PGA-Synthese und -Motilität steuern, sind komplex und weitere Arbeiten sind erforderlich, um die Zusammenhänge zwischen beiden besser zu verstehen.

Aus unseren Experimenten geht klar hervor, dass hohe Temperaturen die Kolonie dazu veranlassen, dem Agarsubstrat eine beträchtliche Flüssigkeitsmenge zu entziehen. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass PGA Bakterien Schutz bieten und das Überleben unter vielen verschiedenen Umweltbelastungen erhöhen kann54,55,56,57. Es ist plausibel, dass, wenn ein Biofilm erhöhten Temperaturen ausgesetzt ist, die Produktion von PGA die Feuchtigkeit, die andernfalls durch Verdunstung verloren gehen könnte, sowohl abfängt als auch zurückhält, wodurch ein Austrocknen der Kolonie verhindert wird. Unsere Beobachtung des Beginns der Motilität verdeutlicht einen weiteren potenziellen Vorteil der PGA-Produktion in einer sich verändernden Umgebung: Die aktive (oder sogar passive) Ausbreitung kann die Flucht und die Suche nach geeigneteren Umgebungen für die Kolonisierung erleichtern.

Die Biofilmmatrix von B. subtilis und V. cholerae wurde als viskoses Hydrogelnetzwerk modelliert, das die Biofilmexpansion über den Zufluss osmotischer Flüssigkeit erleichtert58,59,60,61. Es wird angenommen, dass die Lokalisierung der EPS-Produktion an der Ausbreitungsgrenze einer wachsenden Kolonie die Ausbreitung des Biofilms nach außen vorantreibt. Die gleichzeitige Produktion von Osmolyten stimuliert die Flüssigkeitsextraktion, die die Matrix an der Wachstumsgrenze anschwellen lässt und so die Bewegung vorantreibt. In unseren Experimenten scheint PGA den gegenteiligen Effekt zu haben: Die Kolonieexpansion kommt zum Stillstand, da die Kolonie in einen „flüssigkeitsähnlichen“ Zustand übergeht, wenn Flüssigkeit aus dem Substrat extrahiert wird. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Ausbreitung des Kolonie-Biofilms stark durch mechanische Kontaktkräfte zwischen benachbarten Zellen und Reibung mit dem darunter liegenden Substrat bestimmt wird62,63,64. In unseren Experimenten beginnt die Expansion erst dann wieder, wenn sich die flüssige Umgebung auflöst, physische Kontakte wiederhergestellt sind und die Produktion einer Nicht-PGA-Matrix beginnt. Dies wirft eine weitere Frage auf: Wie kommt es zur Kolonieexpansion, wenn PGA die primäre Matrixkomponente ist? Unsere Experimente bei hohen Temperaturen zeigen, dass sich der Wildtyp-Stamm 3610 deutlich über den anfänglichen Ablagerungsfußabdruck hinaus ausdehnt. Stämme, die weder EPS noch Surfactin produzieren, expandieren nicht so stark wie der Wildtyp, was darauf hindeutet, dass diese Komponenten eine Rolle bei der Erleichterung der Kolonieexpansion spielen (ergänzende Abbildung 10).

Die wandernden Flüssigkeitswellen im epsA-O-defizienten Stamm führen zum Auftreten fingerartiger Strukturen, wenn sich die Welle nach innen ausbreitet. Solche Fingerinstabilitäten können auftreten, wenn eine Flüssigkeit mit niedriger Viskosität eine Flüssigkeit mit höherer Viskosität verdrängt; Die umgekehrte Situation führt typischerweise zu einer stabilen Schnittstelle. Merkwürdigerweise kommen die Finger in unseren Experimenten in der umgekehrten Konfiguration vor. Solche inversen Saffman-Taylor-Instabilitäten können durch die Zugabe benetzbarer Partikel entstehen, die an der Luft-/Flüssigkeitsgrenzfläche adsorbieren und Grenzflächeninstabilitäten hervorrufen können65. Es ist bekannt, dass sich Bakterien an Grenzflächen ansammeln können66, und B. subtilis zeigt dies durch die Bildung schwebender (Pellicle-)Biofilme. Wir spekulieren, dass sich in unserem experimentellen System die B. subtilis-Zellen an der Vorderseite der einfallenden Flüssigkeitswelle ansammeln, wodurch die Grenzflächenenergetik verändert und die Grenzfläche zwischen der Flüssigkeit und der Luft destabilisiert wird, was zu der beobachteten Fingerinstabilität führt. Die Lokalisierung von Zellen an diesen Grenzflächen kann auch zu Zelldichtegradienten führen, die sich wiederum als Muster im reifen Biofilm entwickeln können. Es muss noch mehr Arbeit geleistet werden, um die biologischen und physikalischen Mechanismen aufzudecken, die dieses ungewöhnliche Phänomen verursachen, und um mögliche Vorteile oder Funktionen in ökologischen Umgebungen aufzudecken.

Unsere Experimente bei mittleren Temperaturen (38 °C) deuten auf eine räumliche Trennung zwischen PGA-produzierenden Zellen am Rand des Koloniebiofilms und Matrix-produzierenden Zellen in der Mitte hin (wie bereits berichtet67), was zu einer ringförmigen Eingrenzung von führt Flüssigkeit. Eine solche räumliche und zeitliche Heterogenität ist ein häufiges Merkmal von Biofilmen, bei denen die lokale Mikroumgebung den phänotypischen Zustand der Zellen stark beeinflussen kann. Phänotypische Heterogenität innerhalb eines Biofilms kann durch Variationen in der chemischen oder physikalischen Umgebung68,69, genotypische Variationen und stochastische Genexpression68 erzeugt werden.

Die durch die anfänglichen Ablagerungsbedingungen bedingte Heterogenität der Zelldichte – und die Bildung des „Kaffeerings“ – führt zu dem räumlichen Muster der Flüssigkeitsextraktion, das wir beobachten. Dies ist jedoch nicht die einzige Möglichkeit, Dichteunterschiede innerhalb eines Biofilms zu erzeugen. Aggregate, die beim Wachstum in Flüssigkultur entstehen, können Flecken mit höherer Zelldichte entlang der Ablagerungsfläche bilden. Tatsächlich beobachten wir, dass eine Flüssigkeitsinvasion und daraus resultierende PGA-Produktion in kleinen lokalisierten Regionen weit entfernt vom „Kaffeering“ auftreten können (Zusatzfilm 23). Dies deutet darauf hin, dass es eine gewisse kritische Zelldichte gibt, die bestimmt, ob eine einzelne Zelle einen PGA-produzierenden Zustand anstelle eines Matrix-produzierenden Zustands annimmt.

Die räumliche Heterogenität ist bei 38 °C vorübergehend und EPS wird zur dominanten Matrixkomponente, die die Morphologie des Biofilms im großen Maßstab bestimmt. Der Flüssigkeitsfluss wird letztendlich durch die Produktion des EPS-Elements der Matrix im mittleren Bereich des Biofilms gestoppt (Abb. 6b). Die beweglichen Zellen, die sich in der Nähe der EPS-produzierenden Zellen befinden, scheinen abrupt ihre Bewegung einzustellen, und eine feste Front breitet sich schnell von der Mitte der Kolonie nach außen aus. Ein Mechanismus, der diesen Übergang erklären könnte, beinhaltet die Aktivierung einer „molekularen Kupplung“ wie EpsE, die an FliG bindet und einen Motilitätsstopp auslöst70. Allerdings können wir EpsE als Kandidaten ausschließen, da wir eine Ausbreitung der Motilitätsblockierungsfront im Stamm epsA-O beobachten. Es bleibt eine offene Frage, welche physikalischen oder biologischen Mechanismen dieses schalterartige Phänomen steuern.

Der „Kaffeering“ ist der anfängliche Bereich höherer Dichte, der nach der Ablagerung auf der Agaroberfläche gebildet wird. a Niedrige Temperaturen erzeugen eine Biofilmmatrix, die reich an EPS und TasA (gelb) ist. b Mittlere Temperaturen induzieren die PGA-Produktion (blau) und (i) die damit einhergehende Flüssigkeitsextraktion aus dem Agar, der aus der Region mit hoher Dichte stammt. (ii) Die Flüssigkeit breitet sich zum Zentrum aus, wo (iii) die EPS- und TasA-Matrixproduktion ihren Fortschritt stoppt. c Hohe Temperaturen führen zu einer PGA-reichen Matrix, die (i) eine Flüssigkeitsextraktion induziert, die (ii) den gesamten Biofilm bedeckt, was zu einem schleimigen Phänotyp führt.

Bei niedrigen Temperaturen beobachteten wir nicht die phänotypische Heterogenität, die wir bei mittleren Temperaturen beobachten, vermutlich aufgrund einer fehlenden PGA-Produktion (Abb. 6a) trotz der hohen Zelldichte im Kaffeering. Umgekehrt sind Biofilme bei hohen Temperaturen außerordentlich schleimig und weisen keine erkennbare Struktur auf, die typisch für einen B. subtilis-Biofilm ist (Abb. 6c). In beiden Extremen wird jede von der Zelldichte abhängige PGA-Produktion durch einen temperaturabhängigen Weg ersetzt, der sich auf den gesamten Biofilm auswirkt.

Als die bei hohen Temperaturen gebildeten Biofilme (ergänzende Abbildung 10) durch die Einführung einer Mutation in sinR so konstruiert wurden, dass sie die TasA-Fasern und das Exopolysaccharid überproduzieren, waren sie stark schleimig, besaßen aber auch eine Morphologie, die eher für einen Wildtyp-B. subtilis-Biofilm typisch ist . Dies impliziert, dass die Produktion von PGA gleichzeitig mit EPS/TasA erfolgen kann, selbst wenn einzelne Zellen in der Population sich auf die Produktion des einen oder anderen Produkts festlegen. Diese Aufspaltung in zwei Populationen wird durch unsere Ergebnisse bei mittleren Temperaturen nahegelegt, bei denen die beiden Zelltypen gleichzeitig, aber in unterschiedlichen Regionen des Biofilms vorhanden zu sein scheinen.

Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Stämme mit einer Deletion von spo0A bei niedrigen Temperaturen (30 °C) zu schleimigen und unstrukturierten Biofilmen führen, und dass dies auf die PGA-Produktion zurückzuführen ist27,71. Daher ahmt eine spo0A-Mutante weitgehend den Wildtyp-Biofilm-Phänotyp nach, den wir bei hohen Temperaturen beobachten. Dies impliziert, dass Spo0A möglicherweise die regulatorische Komponente ist, die die temperaturabhängige Produktion einer PGA-reichen oder EPS/TasA-reichen Biofilmmatrix steuert.

Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass B. subtilis die Fähigkeit besitzt, unterschiedliche Biofilmmatrizen mit unterschiedlichen Eigenschaften zu produzieren, um sich an unterschiedliche Umweltbedingungen anzupassen. Eine solche Strategie kann in natürlichen Umgebungen angewendet werden, da B. subtilis in einem weiten Temperaturbereich wachsen kann: Es kommt in Wüstenböden und in Komposten vor, die leicht Temperaturen von 50 °C erreichen können. Bisher wurde nicht angenommen, dass PGA ein wichtiger Faktor als Matrixkomponente in B. subtilis NCIB 3610-Biofilmen ist37. Es scheint jedoch, dass PGA unter den richtigen Bedingungen zu einer alternativen Matrixkomponente mit ausgeprägten strukturellen und physikalischen Eigenschaften werden kann, die dem Biofilm helfen können, unter Hochtemperaturbedingungen zu überleben.

B. subtilis-Stämme wurden zunächst in LB-Medium (10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt und 10 g Trypton pro Liter) gezüchtet. Biofilme wurden auf MSgg-Agar (5 mM Kaliumphosphat und 100 mM MOPs bei pH 7,0, ergänzt mit 2 mM MgCl2, 700 μM CaCl2, 50 μM MnCl2, 50 μM FeCl3, 1 μM ZnCl2, 2 μM Thiamin, 0,5 % v/v Glycerin) gezüchtet , 0,5 % w/v Glutamat, 1,5 % w/v Select Agar (Invitrogen). Gegebenenfalls wurden Antibiotika nach Bedarf in den folgenden Konzentrationen verwendet: Chloramphenicol bei 5 μg ml–1, Kanamycin bei 25 μg ml–1, Spectinomycin bei 100 μg ml–1 und Tetracyclin bei 10 μg ml–1.

Alle in dieser Studie verwendeten Stämme sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Alle in dieser Arbeit verwendeten B. subtilis-Stämme stammen aus dem Wildtyp-Laborisolat NCIB 3610 und wurden unter Verwendung von Standardprotokollen konstruiert. Die SPP1-Phagentransduktion wurde für den Transfer genomischer DNA vom Spenderstamm in den Empfängerstamm NCIB 3610 verwendet.

Koloniebiofilme wurden 24 Stunden lang gezüchtet. Anschließend wurde die Biomasse von der Agaroberfläche geerntet und in ein 500-μl-Aliquot BugBusterⓇ Mastermix (Merck) gegeben. Das Material wurde durch wiederholte Passage durch eine 23-Gauge-Nadel und anschließende Ultraschallbehandlung (30 % Amplitude, 10 s) aufgebrochen. Die Proben wurden 20 Minuten lang bei 21 °C (unter Rühren) inkubiert und 10 Minuten lang bei 4 °C (17.000 × g) zentrifugiert. Der Überstand wurde zurückbehalten und enthielt PGA und extrahierte Proteine. Die Proben wurden mit einem Pierce BCA-Protein-Assay-Kit (Thermo Scientific) quantifiziert und vor der weiteren Analyse bei –20 °C gelagert.

Proben mit 10 μg Gesamtprotein (normalisiert auf 25 μl in 1x Laemelli-Probenpuffer) wurden durch SDS-PAGE (12 % w/v Auflösungsgel und 7 % w/v Stapelgel) zusammen mit einer Molekulargewichtsleiter (Precision Plus Protein) analysiert Duale Farbstandards (Biorad)). Alle Gele wurden parallel verarbeitet und bei 180 V betrieben, bis die blaue Farbstofffront im Probenladefarbstoff den Boden des Gels erreichte. Die Acrylamidgele wurden gründlich mit Wasser gespült und 1 Stunde lang unter leichtem Schaukeln in Instant Blue Coomassie-Proteinfärbemittel (Abcam) eingeweicht. Nach der Inkubation im Farbstoff wurden die Gele mit entionisiertem Wasser gespült und mit einem Molecular Imager Gel Doc XR-System (Biorad) abgebildet. Die Gele wurden außerdem 10 Minuten lang in 0,5 % (Gew./Vol.) Methylenblau in 3 % (V/V) Essigsäure eingeweicht und dann wiederholt in entionisiertem Wasser gewaschen, bis der nicht gebundene Hintergrundfarbstoff entfernt war.

B. subtilis-Stämme wurden in 3 ml LB einer einzelnen Kolonie, die auf 1,5 % w/v LB-Agar gewachsen war, inokuliert. Man ließ die Bakterien bei 30 °C unter orbitalem Schütteln mit 200 U/min wachsen, bis sie eine OD zwischen 1,5 und 2 erreichten. Die Zellkultur wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf OD600 1,0 verdünnt. Ein 3-μl-Tröpfchen Bakterien wurde auf eine 35-mm-Petrischale (Corning) mit MSgg-Agar aufgetragen. Man ließ die Bakterientröpfchen 10 Minuten lang trocknen. Für durch Schleuderbeschichtung hergestellte Proben wurde eine Petrischale mit MSgg-Agar auf einen Vakuum-Schleuderbeschichter (Cammax Precima) gestellt, der mit 2000 U/min rotierte. Ein 10-μl-Tröpfchen Bakterien wurde auf den rotierenden Agar gegeben. Für alle Experimente wurde die Petrischale auf ein temperaturgesteuertes Nikon Ti-Umkehrmikroskop gestellt. Alle Mikroskopiebilder und -filme wurden mit einer CoolSNAP HQ2 CCD-Kamera aufgenommen, die von der μManager-Software gesteuert wird. Hellfeldfilme und Bilder der Biofilme wurden von der Unterseite der Petrischale aufgenommen und durch den Agar (Dicke ~ 4 mm) abgebildet. Bei der Bildaufnahme wurden Nikon Plan 2x UW- und 10X Plan Fluor-Objektive verwendet. Zusätzliche Biofilmaufnahmen wurden mit einem Leica MZ16-Stereoskop durchgeführt. Für die Bead-Tracking-Experimente wurden gelb fluoreszierende Latex-Carboxylat-modifizierte Polystyrolkügelchen (Sigma-Aldrich) mit einem Durchmesser von 1 μm aus der Stammlösung im Verhältnis 1:1000 in PBS verdünnt. 1 μL der Arbeitslösung wurde unmittelbar vor der Ablagerung zu 1 ml der verdünnten Zellkultur gegeben. Die Filme wurden in hellen und epifluoreszierenden Kanälen aufgenommen (Nikon GFP-Fluoreszenzfilterwürfel) und die Perlen wurden mit dem ImageJ-Plugin TrackMate (v3.8.0)72 verfolgt. Die Bildanalyse wurde unter Verwendung der Fidschi-Verteilung von ImageJ durchgeführt. Mikroskopische Bilder des gesamten Biofilms wurden wie oben aufgenommen, jedoch in mehreren Kacheln, die mit dem Plug-in „Pairwise Stitching“ zusammengefügt wurden. Die Bilder der Fingerinstabilitäten wurden erstellt, indem zunächst mit dem Werkzeug „Begradigen“ ein kreisförmiger in einen linearen Bereich umgewandelt wurde. Zur Binärisierung der Bilder wurde die standardmäßige ImageJ-Schwellenwertmethode angewendet. In Fällen, in denen die Intensität über das Bild hinweg variierte, wurde das Bild in Bereiche ähnlicher Intensität unterteilt und anschließend eine Schwellenwertbildung durchgeführt. Das Tool „Kantenfindung“ wurde verwendet, um die Kanten der Schwellenwertbilder zu lokalisieren. Nachdem die Kanten identifiziert wurden, wurde der Innenraum ausgefüllt, um eine Darstellung der Finger zu erhalten. Wenn das Bild partitioniert war, wurde es mit dem Stitching-Tool in ImageJ zusammengefügt. Die Messung der Flüssigkeitswegstrecke wurde manuell in ImageJ verfolgt und die mittlere Verschiebung wurde über 10 separate Messungen für jedes Experiment gemittelt. Für jeden untersuchten Stamm wurden drei separate Experimente durchgeführt. Kanten- und Frontverschiebungsmessungen wurden in ImageJ auf ähnliche Weise durchgeführt, indem die Bewegung der Front über aufeinanderfolgende Bilder hinweg manuell verfolgt wurde. Verschiebungen wurden immer relativ zur Anfangsposition jedes Merkmals gemessen. Die PIV-Analyse wurde mit PIVlab (v2.39)73,74 durchgeführt. Die Bilder wurden zunächst mit einem CLAHE-Filter mit einer Fenstergröße von 20 Pixel verarbeitet. Es wurden drei Abfragedurchgänge mit Fenstergrößen von 64/32 Pixel, 32/16 Pixel und 16/8 Pixel verwendet. Der verwendete Subpixelschätzer war der Gauss 2x3-Punkt. Bildmasken wurden angewendet, um die Schätzung falscher Vektoren einzuschränken, und Vektoren wurden abgelehnt, wenn sie 5 Standardabweichungen vom Mittelwert überstiegen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle in dieser Studie verwendeten Daten werden im Edinburgh DataShare (https://doi.org/10.7488/ds/3473) hinterlegt. Sämtliche Daten stehen auf Anfrage auch den entsprechenden Autoren zur Verfügung.

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Wir danken M. Porter und F. Davidson für ihre hilfreichen Kommentare. Die Arbeit in den NSW- und CEM-Labors wird vom Biotechnology and Biological Science Research Council (BBSRC) finanziert [BB/P001335/1, BB/R012415/1, BB/T00875X/1].

National Biofilms Innovation Centre, School of Physics and Astronomy, The University of Edinburgh, Edinburgh, EH9 3FD, Großbritannien

Ryan J. Morris und Cait E. MacPhee

Abteilung für Molekulare Mikrobiologie, School of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, DD1 5EH, Großbritannien

David Stevenson, Tetyana Sukhodub und Nicola R. Stanley-Wall

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Von RJM, NSW und CEM entworfene Experimente. RJM und DS führten Experimente durch. TS führte Experimente durch und erzeugte Bakterienstämme. RJM, CEM und NSW haben das Papier geschrieben und bearbeitet. Alle Autoren einigten sich auf die endgültige Fassung des Papiers.

Korrespondenz mit Ryan J. Morris oder Nicola R. Stanley-Wall.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Morris, RJ, Stevenson, D., Sukhodub, T. et al. Die dichte- und temperaturgesteuerte Flüssigkeitsextraktion in einem bakteriellen Biofilm wird durch die Produktion von Poly-γ-glutaminsäure bestimmt. npj Biofilms Microbiomes 8, 98 (2022). https://doi.org/10.1038/s41522-022-00361-5

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Eingegangen: 04. Juni 2021

Angenommen: 29. November 2022

Veröffentlicht: 17. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-022-00361-5

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