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Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 18146 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Bakterielle Biofilme sind komplexe Bakterienkolonien, die an einer statischen Oberfläche und/oder aneinander haften. Bakterielle Biofilme weisen eine hohe Resistenz gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen auf und können lebensbedrohliche nosokomiale Infektionen verursachen. Trotz der Bemühungen der wissenschaftlichen Gemeinschaft, die Bildung und das Wachstum bakterieller Biofilme zu untersuchen, ist die anfängliche Interaktion von Bakterien mit einer Oberfläche und die anschließende Bildung von Biofilmen im Frühstadium immer noch unklar. In dieser Studie präsentieren wir eine markierungsfreie Echtzeitüberwachung der Interaktion von Escherichia coli- und Pseudomonas aeruginosa-Bakterien mit unbehandelten Glaskontrolloberflächen und Oberflächen, die mit Benzalkoniumchlorid behandelt wurden, einer chemischen Verbindung, die für ihre antimikrobiellen Eigenschaften bekannt ist. Die Untersuchung des Grundsatznachweises wurde in einem standardmäßigen inversen optischen Mikroskop durchgeführt, wobei das optische Phänomen der Ätzwirkung als Instrument zur Überwachung der Bakteriendiffusion und der frühen Adhäsion sowie der damit verbundenen Lebensfähigkeit genutzt wurde. Das verbesserte Auflösungsvermögen des optischen Aufbaus ermöglichte die Überwachung und Charakterisierung der Dynamik der Bakterien, was Beweise für den Zusammenhang zwischen der Adhäsionsdynamik und der Lebensfähigkeit der Bakterien sowie für die Fähigkeit zur Bildung eines Biofilms lieferte. An der Oberfläche anhaftende lebensfähige Bakterien zeigten eine spürbare Gleit- oder Rotationsdynamik, während durch Oberflächenkontakt abgetötete Bakterien nach dem Anhaften an der Oberfläche statisch blieben. Dieser Unterschied in der Dynamik ermöglichte die frühzeitige Erkennung der Biofilmbildung und bietet das Potenzial, die Wirksamkeit antimikrobieller Oberflächen und Beschichtungen zu quantifizieren.

Biofilme sind komplexe dynamische mikrobielle Gemeinschaften, die sich auf Oberflächen ansiedeln und wachsen. Der Übergang vom individuellen Planktonzustand (einzelne in Lösung schwimmende Bakterienzelle) zu einem Biofilm erhöht die Antibiotikaverträglichkeit der Bakterien und ihr Wachstum auch unter ungünstigen Bedingungen1. Innerhalb des Biofilms sind Bakterien in einer selbstproduzierten extrazellulären Matrix eingeschlossen, die aus extrazellulären Polymersubstanzen (EPS) besteht, die zusammen mit kohlenhydratbindenden Proteinen, adhäsiven Strukturen wie Pili und Flagellen und extrazellulären Substanzen als stabilisierendes Gerüst fungieren die dreidimensionale Struktur des Biofilms. Diese Struktur versorgt Bakterien mit der richtigen Menge an Nährstoffen, die sie für ihr Wachstum und ihre Fortpflanzung benötigen, verbessert die Zell-zu-Zell-Interaktionen, den DNA-Austausch und schützt die Biofilmkomponenten vor Austrocknung, Raub und anderen äußeren schädlichen Einflüssen2.

Die Mechanismen der Bakterienadhäsion und Biofilmbildung werden durch mehrere physikalische, chemische und biologische Faktoren bestimmt. Die erste Phase der Biofilmbildung betrifft die individuelle Anheftung eines einzelnen Bakteriums an eine Oberfläche. Einzelne Bakterienzellen werden entweder durch physikalische Kräfte oder durch eine intrinsische Fortbewegungsfähigkeit an die Oberfläche transportiert. Bewegliche Bakterien nutzen Strukturen wie Flagellen, um sich der Oberfläche zu nähern, gesteuert durch chemotaktische, aerotaktische oder phototaktische Reaktionen. Die Motilität fördert sowohl die anfängliche Interaktion mit der Oberfläche als auch die Bewegung entlang dieser. Andererseits werden unbewegliche Zellen durch Diffusions- und Sedimentationsprozesse oder durch den Fluss der Flüssigkeit, in der sie suspendiert sind, an die Oberfläche abgegeben3. Sobald sich ein Bakterium der Oberfläche genähert hat, wird die anfängliche Bindung reguliert durch: anziehende und abstoßende Kräfte, hauptsächlich Van-der-Waals- und elektrostatische Wechselwirkungen; die Eigenschaften der Oberfläche wie Textur, Rauheit und Hydrophobie; und die Eigenschaften der Lösung wie pH-Wert und Temperatur4. Allerdings können sich anhaftende Bakterien aufgrund hydrodynamischer Kräfte, abstoßender Kräfte oder als Reaktion auf die Nährstoffverfügbarkeit von der Oberfläche lösen und in einem Prozess, der als reversible Adhäsion bezeichnet wird, wieder in den planktonischen Zustand eintreten5. Wenn die Umweltbedingungen günstig sind, heftet sich ein Bakterium dauerhaft an die Oberfläche und beginnt mit der Sekretion von EPS, wodurch eine dauerhafte Verbindung mit der Oberfläche aufgebaut wird (sogenannte irreversible Adhäsion) und die Anlagerung weiterer Bakterien begünstigt wird6. Irreversibel anhaftende Bakterien sezernieren weiterhin EPS und bilden so eine Mikronische, die für ihr Überleben, ihre Vermehrung und ihren Zusammenhalt günstig ist. Das Vorhandensein zweidimensionaler Mikrokolonien interagierender Bakterien, die an einer Oberfläche haften, stellt die frühe Phase des Bildungsprozesses von Biofilmen dar7. Der bakterielle Biofilm entwickelt sich aus einer zweidimensionalen Monoschicht irreversibel gebundener Bakterien zu einer dreidimensionalen mehrschichtigen Kolonie, die weiter wächst und Hunderte von Mikrometern in das umgebende Medium hineinragt. Diese Biofilmstruktur fungiert als primitives Kreislaufsystem, das die einzelnen Zellen verbindet und den Nährstoffaustausch und die Abfallbeseitigung ermöglicht. In diesem Endstadium wird der Biofilm schließlich durch den Druck zerstört, der durch die ständig wachsende Anzahl von Bakterien oder durch die Einwirkung äußerer Kräfte wie Flüssigkeitsscherung oder Abrieb entsteht. Anschließend verteilen sich die Bakterien wieder im umgebenden Medium und können ein neues Substrat besiedeln und infizieren (Abb. 1)8.

Schematische Darstellung der fünf Stadien der Biofilmbildung8.

Bis zu 80 % der nosokomialen Infektionen in den USA sind auf bakterielle Biofilme zurückzuführen. Aufgrund ihrer Anpassungsfähigkeit und höheren Antibiotikaresistenz können sich bakterielle Biofilme leicht auf medizinischen Geräten und menschlichem Gewebe bilden und zu chronischen und lebensbedrohlichen Infektionen führen9. Daher sind Methoden zur Verhinderung der Bildung von Biofilmen oder zur Aktivierung des Immunsystems zur Ausrottung dieser Gemeinschaften von entscheidender Bedeutung für die wirksame Bekämpfung biofilmbedingter Krankheiten.

Mit der Entwicklung einer Reihe sogenannter antimikrobieller Oberflächen wurden bereits mehrere Strategien untersucht, um die Bildung von bakteriellem Biofilm und die daraus resultierende Infektion zu verhindern. Die meisten dieser Oberflächen sind darauf ausgelegt, Bakterien bei Kontakt oder in unmittelbarer Nähe durch die Freisetzung antimikrobieller Substanzen abzutöten (biozide Oberflächen)10.

Trotz erheblicher Anstrengungen zur Charakterisierung und Verhinderung der Biofilmbildung und aufgrund der Vielfalt der beteiligten Kräfte ist ein klares Verständnis der anfänglichen Wechselwirkung zwischen Bakterien und Oberfläche und der anschließenden Biofilmbildung im Frühstadium erforderlich, um wirksame antimikrobielle Strategien zu entwickeln und deren Umsetzung in den Organismus zu unterstützen -vivo- und reale Szenarien. In dieser Studie haben wir in Echtzeit die Dynamik und Oberflächeninteraktionen von E. coli- und P. aeruginosa-Bakterien überwacht, die Glasoberflächen mit oder ohne antimikrobieller Beschichtung ausgesetzt waren, ohne die Bakterien zu kennzeichnen. E. coli ist ein gramnegatives, stäbchenförmiges, nicht sporulierendes Bakterium, das als Modellorganismus für Studien in der Biotechnik und industriellen Mikrobiologie gilt. Die meisten E. coli-Stämme sind für den menschlichen Körper harmlos und kommen im Darm warmblütiger Lebewesen vor. Allerdings sind mehrere E. coli-Stämme pathogen und für Infektionen in verschiedenen medizinischen Geräten verantwortlich, beispielsweise in Harnröhren- und intravaskulären Kathetern, Gelenkprothesen, Shunts und Transplantaten11. E. coli-Biofilm kann auch für Haut- und Weichteilinfektionen verantwortlich sein12. P. aeruginosa ist ein gramnegatives, stäbchenförmiges, asporogenes und monoflagelliertes Bakterium, das dafür bekannt ist, schwere Infektionen bei immungeschwächten Patienten mit Krebs und Patienten mit schweren Verbrennungen und Mukoviszidose zu verursachen13.

Die Bildgebung von Bakterien wird üblicherweise mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt, da sie das niedrige Auflösungsvermögen und den geringen Kontrast verbessert, die mit herkömmlicher Hellfeldmikroskopie erreichbar sind. Angesichts der Einschränkungen der Fluoreszenzmikroskopie, einschließlich Photobleichung und Phototoxizität, und des Mangels an Wissen über die Auswirkungen der Exposition gegenüber Fluoreszenzfarbstoffen auf bakterielle Funktionen und Prozesse wurden jedoch Strategien entwickelt, um eine markierungsfreie Überwachung von Bakterienzellen und ihren Zellen durchzuführen anfängliche Haftung auf einer Oberfläche. Neben anderen Techniken ist die Phasenkontrastmikroskopie eine der effektivsten markierungsfreien optischen Techniken im Hinblick auf Auflösung und Kontrast des erfassten Bildes und ermöglicht die dreidimensionale Verfolgung einer Bakterienzelle in einfachen und komplexen Umgebungen14. Allerdings erfordert die Phasenkontrastmikroskopie einen speziellen und teuren optischen Aufbau, der mit einem speziellen Kondensor mit einem Kondensorring und gekoppelten Objektiven ausgestattet ist, die durch das Vorhandensein von Phasenplatten gekennzeichnet sind, die für die Verzögerung der gebeugten Strahlen verantwortlich sind15. Eine weitere optische Technik, die die Phasenkontrastmikroskopie ergänzt und kontrastreiche Bilder biologischer Organismen erzeugen kann, ist die Differential-Interferenzkontrastmikroskopie. Die hohe Auflösung und der Kontrast werden durch die Verwendung zweier interferierender kohärenter Strahlen erreicht. Die Technik ist in der Lage, menschliche16 und Bakterienzellen17 sichtbar zu machen; Allerdings ist dafür ein spezieller und kostspieliger optischer Aufbau erforderlich, der mit einer Reihe von Polarisatoren und Prismen ausgestattet ist.

In dieser Studie wurde die Bildgebung durch die Erzeugung ätzender Signaturen von Bakterienpopulationen durchgeführt, was deren Überwachung in einem herkömmlichen inversen optischen Mikroskop mit nur wenigen einfachen Anpassungen und ohne die Notwendigkeit einer Fluoreszenzmarkierung ermöglichte. Das hohe Auflösungsvermögen des auf Kaustik basierenden optischen Aufbaus ermöglichte die qualitative Charakterisierung der Dynamik von E. coli- und P. aeruginosa-Bakterien und die Erkennung vorläufiger Bakterien-Oberflächen-Wechselwirkungen, wodurch Echtzeitinformationen über Bakterien bereitgestellt wurden, die einen Biofilm bilden und sich darauf vermehren der Zieloberfläche.

Ziel der Studie war es, den Mechanismus der Anlagerung von Bakterien an Oberflächen zu untersuchen und den möglichen Zusammenhang zwischen der Dynamik, die Bakterien bei der Interaktion mit der Oberfläche zeigen, und ihrer Lebensfähigkeit bzw. Fähigkeit, einen Biofilm zu bilden, qualitativ zu charakterisieren. Die Ergebnisse liefern Hinweise auf Zusammenhänge zwischen der Bakteriendynamik und der Bildung eines Biofilms, die direkte Auswirkungen auf die Charakterisierung der Wirksamkeit antimikrobieller Oberflächen sowie auf die Bewertung der Bildung von Biofilmen im Frühstadium haben. Die in dieser Studie beschriebene und eingesetzte Technologie kann verwendet werden, um Daten in Form von Echtzeitbildern zu generieren und so kostengünstige, markierungsfreie Studien zur Wirksamkeit antimikrobieller Oberflächen in vitro zu ermöglichen.

Die bakterielle Bildgebung wurde am nicht beweglichen Stamm E. coli ATCC 10536 und am beweglichen Stamm P. aeruginosa ATCC 15442 durchgeführt. Beide Stämme werden häufig für antimikrobielle Untersuchungen verwendet. Bakterienkulturen über Nacht wurden je nach Bedarf in Luria-Bertani (LB)-Brühe oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1× PBS, pH 7,4) auf McFarland-Standard 0,5 verdünnt, um eine Arbeitskonzentration von etwa 108 KBE/ml zu erhalten. Die Bakterien wurden in reinem PBS oder in einer Lösung von 10 % v/v LB in PBS verdünnt. Die LB-Menge wurde auf eine maximale Konzentration von 10 % v/v begrenzt, um das Wachstum und die Fähigkeit zur Proliferation der Bakterien zu begrenzen und so längere Überwachungszeiten für die Interaktion zwischen einzelnen Bakterien und der Zieloberfläche und die Bildung des Biofilms zu ermöglichen. Der niedrige LB-Grenzwert minimierte auch die ätzenden Signaturen, die von den Nährstoffen im Medium erzeugt werden (siehe beispielsweise Abb. 1 im Zusatzmaterial). Die Dynamik und Wechselwirkungen der Bakterien wurden in einem standardmäßigen optischen Umkehrmikroskop (Axio Observer.Z1 m, Carl Zeiss) überwacht, das auf Antivibrationsfüßen (VIBe, Newport) montiert war, um die Probe von der Umgebung zu isolieren, indem 60 μl Bakterienlösung in einem tiefen Hohlraum verwendet wurden (250 ± 10 μm tief) in Objektträgern. Das Mikroskop war mit einer Monochromkamera (AxioCam ICm1, Carl Zeiss) zur Aufnahme von Bildern und Videos mit bis zu 30 fps und mit einem Inkubationssystem auf dem Tisch (Inkubator PM S1, Heizeinsatz P S1, Temp- und CO2-Modul S1, Carl Zeiss), um die Temperatur und die Menge an vorhandenem CO2 während der Experimente zu kontrollieren. Die Auflösungsleistung des optischen Aufbaus wurde erhöht, indem einige einfache Anpassungen am normalen Aufbau des Mikroskops vorgenommen wurden, indem dem von Patterson und Whelan beschriebenen Verfahren zur Erzeugung ätzender Signaturen der Bakterien gefolgt wurde18. Die ätzenden optischen Signaturen erleichterten die Erkennung der strukturellen Morphologie der Bakterien und die Identifizierung einzelner Bakterien und Bakteriencluster sowie der Dynamik ihrer Wechselwirkungen. Die Rasterelektronenmikroskopie erfordert das Trocknen und Fixieren der Bakterienpopulation, wodurch die dynamischen Wechselwirkungen gestoppt werden. Um die markierungsfreien Ätzsignaturen zu validieren, die mit Bakterien in Lösung und an der Oberfläche verbunden sind, wurden daher Fluoreszenzbilder von Bakterien aufgenommen, die Kontrollglasoberflächen ausgesetzt waren mit dem gleichen optischen Aufbau unter Verwendung einer Fluoreszenzlichtquelle. E. coli-Bakterien wurden mit den Fluoreszenzfarbstoffen SYTO9 und Propidiumiodid (PI) aus dem LIVE/DEAD BacLight-Kit (Invitrogen) angefärbt, einem bekannten Fluoreszenz-Kit zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von Bakterien in Lösung. SYTO 9 ist ein grün fluoreszierender Nukleinsäurefarbstoff, der die Membran sowohl lebender als auch toter grampositiver und gramnegativer Bakterien durchdringen kann, während PI ein rot fluoreszierender Kern- und Chromosomenfarbstoff ist, der für Bakterienzellen mit gestörter Membran durchlässig ist19.

Das LIVE/DEAD BacLight-Kit besteht aus zwei Komponenten:

Komponente A: SYTO 9-Farbstoff, 1,67 mM/PI-Farbstoff, 1,67 mM 300 µL Lösung in DMSO

Komponente B: SYTO 9-Farbstoff, 1,67 mM/PI-Farbstoff, 18,3 mM 300 µL Lösung in DMSO

Da beide Komponenten des Kits gleichzeitig aus SYTO 9- und PI-Farbstoffen bestehen, haben wir uns entschieden, ein anderes Fluorochrom, das Trypanblau, zu verwenden, um die Bakterienpopulation zu färben, die Oberflächen ausgesetzt ist, die mit Benzalkoniumchlorid (BKC) beschichtet sind. Das Trypanblau färbt selektiv nur Bakterienzellen mit zerstörten Membranen, wodurch tote Zellen identifiziert werden konnten.

Die Wirksamkeit von BKC als antimikrobielles Mittel und seine Wirkung auf die Wechselwirkung zwischen Bakterien und Oberflächen wurden getestet, indem eine 0,1 %ige Lösung von BKC in entionisiertem Wasser auf einigen Glasoberflächen verteilt wurde. Die mit BKC behandelten Oberflächen wurden 2 Stunden lang belassen, um die vollständige Verdunstung der BKC-Lösung und die Ablagerung des BKC-Films zu ermöglichen, bevor ihnen Bakterienlösungen ausgesetzt wurden.

Die Dynamik der Bakterien und ihre Wechselwirkungen mit den Oberflächen wurden über einen Zeitraum von 20 Sekunden mit dem ImageJ-Plugin Trackmate ausgewertet, das eine Möglichkeit bot, automatisch Flecken oder annähernd kugelförmige Objekte aus einem 2D- oder 3D-Bild zu segmentieren und sie über die Zeit zu verfolgen20.

Die Bildgebungsfähigkeit des in dieser Studie zur Visualisierung von Bakterien verwendeten optischen Aufbaus wurde anhand der Fluoreszenzmikroskopie validiert, indem aufeinanderfolgende Bilder desselben Bereichs der Probe durch Umschalten vom Ätzmodus in den Fluoreszenzmodus aufgenommen wurden, was die Verwendung einer anderen Lichtquelle erforderte. Abbildung 2 zeigt, dass zwischen den im Ätz- und Fluoreszenzmodus aufgenommenen Bildern kein merklicher Unterschied besteht. Dies bestätigt die Fähigkeit der Ätztechnik, optische Signaturen für alle im Sichtfeld vorhandenen Bakterien zu erzeugen und so eine Echtzeitüberwachung zu ermöglichen Charakterisierung der Bakteriendynamik und -interaktion, ohne dass eine Fluoreszenzmarkierung erforderlich ist. Darüber hinaus ermöglicht der Ätzmodus eine bessere Definition der Makrostruktur der abzubildenden Bakterien.

Vergleich zwischen derselben E. coli-Bakterienpopulation, aufgenommen mit einem inversen optischen Mikroskop im Kaustikmodus (oben) und im Fluoreszenzmodus (unten). E. coli-Bakterien wurden mit den Fluoreszenzfarbstoffen SYTO9 und Propidiumiodid (PI) aus dem LIVE/DEAD BacLight-Kit angefärbt. Es gibt keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden bildgebenden Verfahren. Die drei durch die schwarzen Pfeile im Kaustikbild hervorgehobenen Bakterien befinden sich nicht an der Oberfläche und wurden erfasst, als sie während ihrer zufälligen Diffusion senkrecht zur Oberfläche ausgerichtet waren, was zu einer fast kugelförmigen optischen Signatur führte.

Abbildung 3 zeigt einen Vergleich zwischen der typischen optischen Signatur eines an der Oberfläche haftenden E. coli-Bakteriums, erzeugt im Ätzmodus und im Hellfeldmodus. Der ätzende Modus ermöglicht die Erkennung der Hauptstrukturkomponenten der Bakterien, nämlich der Membran, der Nukleoide und der Z-Ringe zwischen ihnen, die als Gerüst für die Rekrutierung der FtsZ-Teilungsproteine ​​dienen und möglicherweise Kräfte induzieren, die die Zelle zusammenziehen21.

Foto der optischen Signatur, die von einem E. coli-Bakterium erzeugt wird, aufgenommen mit dem optischen Umkehrmikroskop, das in diesem Arbeitsaufbau verwendet wird, für: (a) Kaustikmodus; (b) Hellfeldmodus.

Die Interaktion von E. coli-Bakterien mit Oberflächen wurde untersucht, indem die Dynamik von Bakterien im Kontakt mit der Oberfläche charakterisiert wurde. Standardglaskontrollen und antimikrobielle BKC-Oberflächen wurden verwendet, um die Bandbreite der Wechselwirkungen zwischen Bakterien und Oberflächen zu untersuchen. Es kann davon ausgegangen werden, dass Standardglas eine Positivkontrolle ist, die eine Bakterienadhäsion ermöglicht, während BKC als Negativkontrolle eingesetzt wurde, die als antimikrobiell gilt und anhaftende Bakterien abtötet. Sobald sich ein Bakterium der Glasoberfläche nähert, wird die vorläufige Wechselwirkung hauptsächlich durch elektrostatische und hydrodynamische Wechselwirkungen reguliert. In unserem Versuchsszenario tragen sowohl die Bakterien als auch das Glas eine negative Oberflächenladung. Die äußere Membran von E. coli ist aufgrund der Dissoziation von Carboxyl- und Phosphatgruppen im Peptidoglycan und den Lipopolysacchariden der Zellwände22 negativ geladen, während Glas bekanntermaßen bei Kontakt mit wässrigen Lösungen eine negative Ladung annimmt, hauptsächlich aufgrund der Dissoziation von die Silanolgruppen23:

Die resultierende abstoßende elektrostatische Kraft, die durch die Wechselwirkung zwischen den Bakterien und der Oberfläche erzeugt wird, steht im Gegensatz zur anfänglichen Anhaftung und zwingt die Bakterien dazu, zufällig über die Oberfläche zu diffundieren und dabei eine Brownsche Bewegung zu zeigen (Abb. 4a). Aufgrund der anderen beteiligten Kräfte, wie z. B. Van-der-Waals-Kräfte (Anziehungskräfte) und Gravitationskräfte, können Bakterien jedoch die elektrostatische Abstoßung überwinden und sich an der Oberfläche festsetzen. Abhängig von der Oberfläche der Membran, die an der Oberfläche haftet, und der daraus resultierenden Dynamik der Bakterien können zwei Arten der Anhaftung unterschieden werden: die rotierende Anhaftung, wenn nur eine Extremität des Bakteriums an der Oberfläche haftet und das Bakterium eine Rotationsbewegung aufweist Bewegung um die befestigte Stange (Abb. 4b); und seitliche Anhaftung, wenn das Bakterium über einen Teil seiner Länge an der Oberfläche haftet und das Bakterium eine Translation oder ein Gleiten zeigt (Abb. 4c). Die gleiche Interaktionsdynamik wurde bei Bakterien beobachtet, die sowohl in LB als auch in PBS dispergiert waren (Abb. S1–S4 des online verfügbaren Datensatzes). Diese Arten der Bindung wurden kürzlich von Agladze et al. experimentell mithilfe der Hellfeldmikroskopie untersucht, um die reversible und irreversible Bindung von E. coli-Bakterien zu charakterisieren. Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass die seitliche Anhaftung irreversibel ist und dass Bakterien, die diese spezifische Anhaftung erfahren, keine Bewegung zeigen24. Unsere Ergebnisse zeigen jedoch, dass die anfängliche Bindung auch dann reversibel ist, wenn sie seitlich erfolgt. Abhängig von den auf die Bakterien einwirkenden Kräften kann sich die Art der Bindung von rotierend zu lateral und umgekehrt ändern (Abb. S5–S10 des online verfügbaren Datensatzes). Aufgrund der Vielfalt der beteiligten Kräfte und Wechselwirkungen sollte die Unterscheidung zwischen irreversibler und reversibler Anhaftung daher nicht auf der Grundlage der anhaftenden Oberfläche, sondern unter Berücksichtigung der Zeitskala der Wechselwirkung getroffen werden25. In dieser Studie wurde beobachtet, dass auch seitlich an der Oberfläche befestigte Bakterien nicht stationär waren und nicht einfach statisch an der Oberfläche hafteten, sondern eine Gleitbewegung entlang der Oberfläche zeigten. Berichten zufolge beginnen Bakterien in diesem Stadium mit der Sekretion extrazellulärer Polymersubstanzen (EPS)6. Die EPS-Schicht verstärkt zusammen mit den anziehenden Van-der-Waals-Kräften und Membran-Pili die Adhäsion und erweitert die Oberfläche um ein Bakterium, das durch seine Anwesenheit beeinflusst wird, und fungiert als Nährstofffalle, die die Anlagerung anderer Bakterien erleichtert. Andererseits hafteten Bakterien, die mit der mit BKC beschichteten Glasoberfläche in Kontakt kamen, einfach statisch an der Oberfläche an, was die Erkennung gesunder Bakterien ermöglichte, die in der Lage waren, aus statischen und potenziell toten Bakterien einen Biofilm zu bilden (Abb. 4d). Die Abbildungen 5a, 6 und 7 zeigen ätzende Signaturen für Zellen, die einer mit BKC beschichteten Oberfläche ausgesetzt waren und sich als statisch erwiesen, was bedeutet, dass die Zellen tot waren und an der Oberfläche hafteten, was durch Fluoreszenzanalyse mit Trypanblau bestätigt wurde (Abb. 5b). , ein Farbstoff, der in der Lage ist, in Zellen mit zerstörten Membranen einzudringen26. BKC ist ein kationisches Tensid, das für seine antimikrobiellen Eigenschaften bekannt ist27. Nach der Ablagerung verleiht es der Oberfläche eine positive Nettoladung, zieht die negative Ladung der Bakterien an und führt dazu, dass sie nach der Abgabe an die Oberfläche plötzlich statisch anhaften (Abb. S11–S13 des online verfügbaren Datensatzes). Darüber hinaus ist BKC in der Lage, Proteine ​​zu denaturieren und die Zytoplasmamembran von Bakterien zu zerstören, was zu deren Tod führt28.

Spuren (gelbe Linien) der Abschnitte (violette Kreise) von vier E. coli-Bakterien, die Folgendes erfahren: (a) zufällige Diffusion über der Oberfläche; (b) Drehbefestigung; (c) seitliche Befestigung; (d) statische Bindung. Die Dynamik der vier Bakterien wurde etwa 20 s lang überwacht. Die Länge der Maßstabsbalken beträgt 5 μm.

Mit Trypanblau gefärbte und statisch an eine BKC-Oberfläche gebundene E. coli-Bakterien, abgebildet mit einem inversen optischen Mikroskop im Kaustikmodus (a) und Fluoreszenzmodus (b).

Foto der optischen Signatur eines toten E. coli-Bakteriums.

Population toter E. coli-Bakterien, dispergiert in PBS und 1 Stunde lang einer mit BKC behandelten Glasoberfläche ausgesetzt. Die Länge des Maßstabsbalkens beträgt 20 μm.

Die an E. coli-Bakterien durchgeführte Analyse wurde an P. aeruginosa-Bakterien wiederholt, um festzustellen, ob die von P. aeruginosa-Bakterien gezeigte Flagellen-Motilität die Interaktion mit der Oberfläche beeinflusst. Die erhaltenen Ergebnisse legen nahe, dass P. aeruginosa-Bakterien, sobald sie sich der Oberfläche nähern, mit der Oberfläche interagieren und dabei die gleiche Dynamik aufweisen, die bei nicht begeißelten E. coli-Bakterien beobachtet wird. An Glaskontrollflächen befestigte P. aeruginosa waren nicht statisch, sondern begannen, sich um die befestigte Stange zu drehen (rotierende Befestigung, Abb. 8a) oder an der Oberfläche entlang zu gleiten (laterale Befestigung, Abb. 8b). Das Vorhandensein des Flagellums scheint jedoch den Bewegungsbereich der an der Oberfläche haftenden Bakterien zu vergrößern, was zu einer deutlicheren Rotation oder seitlichen Bewegung entlang der Oberfläche führt (Abb. S15–S16 des online verfügbaren Datensatzes).

Spuren (rote Linien) der Abschnitte (violette Kreise) eines P. aeruginosa-Bakteriums: (a) rotierend befestigt; (b) seitlich befestigt und (c) statisch (tot). Die toten Bakterien hafteten statisch an der Oberfläche, sodass im Laufe der Zeit keine erkennbaren Spuren mehr zu sehen waren. Die Dynamik der beiden Bakterien wurde etwa 20 s lang überwacht. Die Länge der Maßstabsbalken beträgt 5 μm.

Bei E. coli hafteten sogar P. aeruginosa-Bakterien, die einer mit BKC beschichteten Glasoberfläche ausgesetzt waren, plötzlich statisch an der Oberfläche und zeigten während des Beobachtungszeitraums keine Dynamik (Abb. 8c, Abb. S17–S18 des online verfügbaren Datensatzes). ).

Es ist wichtig zu beachten, dass in Abb. 8 keine zufällige Bewegung auftritt, die auf eine Brownsche Bewegung hinweist und für passive Objekte in einer Lösung zu erwarten wäre. Daher erscheint es sinnvoll, die rotierende oder lineare Bewegung von Bakterien, die an einer Oberfläche haften, als Hinweis auf Leben zu betrachten und das Fehlen jeglicher Bewegung als Hinweis auf tote Bakterien, die an der Oberfläche haften.

Bei Kontakt mit unbehandelten Glasoberflächen richteten sich bereits nach zwei Stunden zwei oder mehr Bakterien zusammen und interagierten miteinander, was den Beginn der Bildung einer zweidimensionalen Kolonie oder das erste Stadium eines Biofilms markierte7. Die Bakterien richteten sich halbgeordnet aus und versuchten, den Abstand zwischen ihnen zu minimieren und die Kontaktfläche zwischen ihnen zu vergrößern (Abb. 9, Abb. S19–S20 des online verfügbaren Datensatzes). Nach 24 Stunden stiegen die Bakterienkonzentration und die Größe der Biofilmkolonien proportional zur Menge der Nährstoffe in der Lösung (Abb. 10, 11, 12, 13). Auffällig ist, dass auch bei der Entwicklung einer dreidimensionalen Kolonie die Dynamik des Systems noch erkennbar war (Abb. S21–23 des online verfügbaren Datensatzes). Tatsächlich waren die Bakterien selbst in diesem Stadium der Biofilmbildung nicht statisch, sondern sezernierten weiterhin EPS und interagierten dynamisch mit der Oberfläche und untereinander. Andererseits zeigten die Bilder der Bakterien, die mit BKC behandelten Oberflächen ausgesetzt waren, die Wirksamkeit der antimikrobiellen Verbindung bei der Abtötung der Bakterien bei Kontakt, da es zu keinem Wachstum der Bakterienpopulation und zur Bildung eines Biofilms kam im Zeitverlauf (Abb. 14, 15, Abb. S24 des online verfügbaren Datensatzes).

E. coli-Bakterien gruppieren sich, um Biofilme zu bilden.

Population von E. coli-Bakterien, dispergiert in PBS und 24 Stunden lang einer Glasoberfläche ausgesetzt. Die Länge des Maßstabsbalkens beträgt 20 μm.

Population von P. aeruginosa-Bakterien, dispergiert in PBS und 24 Stunden lang einer Glasoberfläche ausgesetzt. Die Länge des Maßstabsbalkens beträgt 20 μm.

Population von E. coli-Bakterien, dispergiert in einer Lösung von 10 % LB in PBS und 24 Stunden lang einer Glasoberfläche ausgesetzt. Die Länge des Maßstabsbalkens beträgt 20 μm.

Population von P. aeruginosa-Bakterien, dispergiert in einer Lösung von 10 % LB in PBS und 24 Stunden lang einer Glasoberfläche ausgesetzt. Die Länge des Maßstabsbalkens beträgt 20 μm.

Population toter E. coli-Bakterien, dispergiert in PBS und 24 Stunden lang einer mit BKC behandelten Glasoberfläche ausgesetzt. Die Länge des Maßstabsbalkens beträgt 20 μm.

Population toter P. aeruginosa-Bakterien, dispergiert in PBS und 24 Stunden lang einer mit BKC behandelten Glasoberfläche ausgesetzt. Die Länge des Maßstabsbalkens beträgt 20 μm.

In diesem Artikel haben wir eine experimentelle Charakterisierung der Bindungsmechanismen von E. coli- und P. aeruginosa-Bakterien zur Bekämpfung von Glasoberflächen und mit einem antimikrobiellen Mittel beschichteten Glasoberflächen vorgestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Lebensfähigkeit von Bakterien und ihre Fähigkeit, Biofilme zu bilden, untersucht werden können, indem ihre Dynamik und ihre Wechselwirkungen mit der Oberfläche bewertet werden. Gesunde Bakterien, die an der Glaskontrolloberfläche hafteten, zeigten eine erkennbare seitliche oder rotierende Bewegung. Daher ermöglicht die Beobachtung dieser Verhaltensweisen die frühzeitige Erkennung des Auftretens eines potenziellen Biofilms. Andererseits hafteten abgestorbene Bakterien aufgrund der anziehenden elektrostatischen Kraft und des Abbaus ihrer äußeren Membran statisch an den mit BKC behandelten Oberflächen. Unsere Ergebnisse liefern nicht nur neue empirische Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen Bakterien und Oberflächen in Echtzeit, sondern haben auch potenzielle Auswirkungen auf Untersuchungen zur frühen Bildung eines Biofilms oder zur Wirksamkeit einer antimikrobiellen Beschichtung.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind im DataCat-Repository verfügbar unter: https://doi.org/10.17638/datacat.liverpool.ac.uk/1631.

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FG dankt dem UK Engineering and Physical Sciences Research Council für die Finanzierung in Form eines Doktorandenstipendiums.

School of Engineering, University of Liverpool, Brownlow Hill, Liverpool, L69 3BX, Großbritannien

Francesco Giorgi, Judith M. Curran und Ann A. Patterson

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FG führte die Experimente unter der direkten Aufsicht von JMC durch und EAPFG erstellte den ersten Entwurf des Manuskripts und alle Autoren trugen zur Erstellung der endgültigen Version bei. Alle Autoren haben der endgültigen Fassung des Manuskripts zugestimmt.

Korrespondenz mit Francesco Giorgi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Giorgi, F., Curran, JM & Patterson, EA Echtzeitüberwachung der Dynamik und Interaktionen von Bakterien und der Bildung von Biofilmen im Frühstadium. Sci Rep 12, 18146 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22669-0

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Eingegangen: 3. April 2022

Angenommen: 18. Oktober 2022

Veröffentlicht: 28. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22669-0

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